氨基酸對動物的生長、神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育及動物體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的正常代謝都有重要的作用，而且蛋白質(zhì)是動物生長必需的營養(yǎng)物質(zhì)，是評價飼料營養(yǎng)成分的一種重要物質(zhì)，而氨基酸是構(gòu)成蛋白質(zhì)的基本單位，所以氨基酸的種類和含量也就是評價飼料質(zhì)量的根本依據(jù)，從而準確檢測氨基酸的含量和種類具有重要意義。柱后衍生的方法，雖然準確性高，但是耗時長、靈敏度低，所以本文采用柱前衍生的方法以縮短分析時間，增加靈敏度。同時該方法得到的氨基酸衍生物在-20℃可保存數(shù)月，克服了柱前衍生法衍生物不穩(wěn)定的缺點，另外該方法準確性高，用標準品做未知樣品進行檢測，檢測的含量與標準品的標示值非常接近。

(1) 樣品前處理

酸水解法：準確稱取一定量的樣品，使樣品氨基酸總量在50~75mg范圍內(nèi)，置于20~30mL安瓿瓶中，加入10mL含0.1%苯酚的6mol/L鹽酸，振搖使樣品溶解或者是樣品均勻分散在溶液中，將安瓿瓶置于-20℃冰箱中冷凍3~5分鐘，充氮后用噴燈熔封，然后置于110±1℃烘箱中水解24小時，取出冷卻，取水溶液1mL，置于濃縮管中用濃縮儀濃縮至干，加入1mL的0.1mol/L稀鹽酸溶解，用0.45μm濾器過濾后，取清液貯存于冰箱中，供衍生使用。

(2) 衍生方法

準確量取水解后溶液及氨基酸標準品200μL，分別置于1.5mL離心管中，往每只離心管中準確加入正亮氨酸內(nèi)標50μL，然后分別加入三乙胺乙腈溶液100μL和異硫氰酸苯酯乙腈溶液100μL，搖勻室溫靜置衍生1小時。衍生結(jié)束后分別加入400μL正己烷，振搖并靜置10min，取下層溶液200μL并用水稀釋到1mL，混合均勻后用0.45μm針式過濾器過濾即可。

(3) 檢測方法

3.1 溶液配制

流動相A：稱取15.2g無水乙酸鈉，加水1850mL，溶解后用冰醋酸調(diào)pH值到6.5，然后加乙腈溶液140mL，混合均勻并用0.45μm濾器過濾流動相B：80%乙腈水溶液

3.2 高效液相檢測條件

儀器：LC-10F 高效液相色譜儀

色譜柱：Venusil® AA氨基酸分析專用柱4.6×250mm，5μm，100?

流 速：1mL/min；進樣量：10μL

檢測波長：254nm；柱 溫：40℃

檢測梯度如表1















 

(4) 實驗結(jié)果與討論

4.1 液相條件的建立

樣品中氨基酸含量比較低，而且直接檢測溶劑效應較大，經(jīng)過衍生后直接檢測樣品中的氨基酸不能完全分離，本文通過用水稀釋衍生溶液的方法降低檢測中的溶劑效應，并且經(jīng)過優(yōu)化流動相梯度使18種氨基酸得到良好的分離。但是實際檢測過程中相同的檢測條件下，儀器不同，分離效果差別較大，有的甚至都完全分不開，為此本文還開發(fā)了一種基礎(chǔ)檢測條件，可以根據(jù)儀器的自身特點，稍加調(diào)整流動相的比例即可使18種氨基酸的到較好的分離。基礎(chǔ)檢測條件如表2所示。

4.2 檢測方法的穩(wěn)定性、線性及準確性

氨基酸標準品按照1.3方法衍生后，相同的條件下連續(xù)重復進樣6次，計算相對標準偏差，結(jié)果如表3所示。由結(jié)果可知該方法比較穩(wěn)定，可以用來檢測氨基酸樣品，其實驗譜圖如圖1所示。根據(jù)儀器對各個物質(zhì)的響應情況， 將氨基酸標準溶液分別稀釋成2.5μmol/mL(胱氨酸為1.25μmol/mL)、1.25μmol/mL(胱氨酸為0.625μmol/mL)、0.5μmol/mL(胱氨酸為0.25μmol/mL)、0.25μmol/mL(胱氨酸為0.125μmol/mL)、0.125μmol/mL(胱氨酸為0.0625μmol/mL)5個濃度，然后根按照1.3的衍生方法同時衍生處理，樣品經(jīng)稀釋過濾后在相同的實驗條件下進樣，依據(jù)進樣濃度X(μmol/mL)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標進行線性回歸，根據(jù)各個物質(zhì)峰高、噪音，遵循S/N=3計算出最低檢出限，回歸方程及檢出限見表3。可見，在選定的液相色譜條件下氨基酸標準溶液的響應與濃度呈良好的線性關(guān)系。

為了驗證建立方法的準確性，本文用Sigma氨基酸標準品為樣品，以博納艾杰爾科技的標準品為標準品通過相同的方法衍生和檢測得出檢測值與標示值之間的偏差，除胱氨酸外，偏差均小于3%，接近標準品的標示值，證明該方法準確性高，檢測效果穩(wěn)定。實驗結(jié)果如表4。因為半胱氨酸在堿性環(huán)境下能夠轉(zhuǎn)化成胱氨酸，所以經(jīng)堿水解后胱氨酸的含量不穩(wěn)定，此外有時兩個半胱氨酸殘基會發(fā)生二硫鍵交聯(lián)，經(jīng)異硫氰酸苯酯衍生后的胱氨酸也不穩(wěn)定，非常容易分解，所以胱氨酸的相關(guān)系數(shù)和偏差都比較大。

4.3 樣品檢測結(jié)果

按照上述方法檢測處理后的飼料樣品可得色譜圖如圖2、圖3，通過單點校正法可以得出樣品1和樣品2中含有標準品中的17種氨基酸。

樣品中的17種氨基酸均能得到良好的分離，這說明在有基質(zhì)干擾的情況下本文建立的這種方法同樣適用，而且樣品連續(xù)進樣重復性非常好，未出現(xiàn)樣品變質(zhì)或者峰型變差的現(xiàn)象，證明本文建立的方法在有基質(zhì)干擾的情況下也同樣克服了衍生氨基酸容易分解的問題。

4.4 實驗結(jié)論

按照上述實驗條件，可以準確檢測飼料樣品中17種氨基酸，同時檢測的靈敏度及線性都能滿足檢測的要求，而且本方法準確性高，與樣品中含有氨基酸的真值偏差非常小，所以該方法可以準確的檢測飼料樣品中的氨基酸。

(4) 訂貨指南